“泰添力”小肽蛋白部分替代鱼粉对水产养殖生长性能、消化指标和特异性免疫指标的影响

近年来，随着水产养殖业的快速发展，目前已在全世界名列前茅，目前水产养殖成本较高是困扰养殖户的一个难题，在集约化养殖中饲料成本占总养殖成本的60%～80%，这是制约水产养殖业进一步发展的瓶颈。水产配合饲料中主要的蛋白质源是鱼粉，鱼粉作为优质的饲料蛋白质源，其需求量也越来越大，价格也越来越高。为降低养殖成本，有必要寻找替代鱼粉的蛋白质源。由北京金波绿泰科技有限公司生产的“泰添力”小肽蛋白已经做到可以部分替代鱼粉的效果且价格要低于鱼粉。“泰添力”小肽具有促进机体生长、提高机体消化酶活性和增强抗氧化能力的功效，且因其无毒副作用、无耐药性、无残留和等特性而被广泛应用于畜牧及水产动物的饲料中。鉴于此，试验以大菱鲆为研究对象，用“泰添力”小肽蛋白部分替代饲料中的鱼粉，研究其对大菱鲆生长性能、消化指标、特异性免疫指标和肠道组织形态的影响，以期为“泰添力”小肽蛋白在大菱鲆配合饲料中的应用提供参考。

材料与方法
1 试验饲料以鱼粉、虾粉、豆粕为蛋白质源，以鱼油、大豆油为脂肪源，配制含50%鱼粉的基础饲料。用“泰添力”小肽蛋白分别替代基础饲料中0（对照）、8%、16%、24%和32%的鱼粉，配制5种等氮等能的试验饲料，分别记为D₀、D₈、D₁₆、D₂₄、D₃₂组。试验饲料组成及营养水平见表1。“泰添力”小肽蛋白由北京金波绿泰科技有限公司生产，其中分子量在1000道尔顿以下的占90%以上，粗蛋白质含量在83%以上，消化吸收率95%以上，其分子质量分布见表2。配制试验饲料时添加三氧化二钇（Y₂O₃）作为外源指示剂，将各种原料粉碎后过80目筛并按照配方的比例进行混合，其中三氧化二钇采用逐级扩大法均匀混合。将混合后的饲料原料利用膨化机膨化后制作成粒径为1.5mm的颗粒料，放置在烘箱中60℃干燥30min，再自然风干12h后，于-20℃冰柜中保存备用。

2 试验设计及饲养管理试验用大菱鲆来自秦皇岛。大菱鲆先在水族箱中暂养2周，投喂商业饲料。试验开始前先将鱼空腹24h，然后选取体质健壮、大小均匀、体重为（10.32±0.26）g的鱼苗进行饲养试验。饲养试验在实验室的室内循环水族箱（60cm×40cm×50cm）中进行，每箱放养30尾鱼。试验用水是经沙石过滤的天然海水，其盐度为29±1。按照投喂的试验饲料将试验鱼分为5组，每组3个重复（箱）。试验期间每天投喂2次（08:00和20:00），投喂量为鱼体总重的2%～3%。每天投喂饲料2h后用虹吸法清除粪便，每天换水量为箱体的1/3。整个试验过程中24h增氧，每天测定水温，每2周检测1次水体的pH、氨氮含量。整个试验过程中水体温度为（16.5±1）℃，溶氧含量为（7.4±0.2）mg/L，氨氮含量为（0.51±0.12）mg/L，pH为8.0～8.4。

3 样品采集试验开始4周后开始收集粪便，每次投喂饲料1h后用吸管吸出新鲜、饱满、成形的粪便，放入-80℃冰箱中保存备测。试验结束时，大菱鲆空腹24h，称取每箱总重，并记录尾数。用丁香酚进行麻醉然后，从每个水族箱中随机取3尾大菱鲆，用纱布吸干表面水分后称重，在105℃烘箱中烘至恒重，作为全鱼样品进行指标检测。另从每个水族箱随机取空腹24h的大菱鲆8尾，用纱布吸干表面水分后称重并记录；随机取4尾大菱鲆采集血液，制备血浆，并取其前肠和中肠放入David-son’s固定液（由95%乙醇330ml、甲醛220ml、冰醋酸115ml、纯水335ml组成），固定24h后送至医院检测血浆生化指标和肠道切片；另抽取其他4尾大菱鲆的血浆，并摘取8尾大菱鲆的肝脏称重并记录，放入-80℃冰箱保存，用于检测血浆和肝脏代谢酶活性与抗氧化指标以及血浆特异性免疫指标；最后取8尾大菱鲆的背肌，放入-80℃冰箱保存备用。

4 测定指标及方法鱼体、饲料和粪便中水分含量采用烘箱烘干（105℃）失重法测定，粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定，粗脂肪含量采用索氏抽提法（以石油醚为溶剂）测定，粗灰分含量采用马弗炉灰化法（550℃，9h）测定。饲料和粪便中三氧化二钇含量采用SCT1089—2006《鱼类消化率测定方法》中的酸消化比色法测定。大菱鲆血浆、肝脏检测指标均采用试剂盒测定，按照使用说明进行操作。其中，胰蛋白酶（PRS）活性与补体3（C3）、补体4（C4）采用紫外比色法测定；脂肪酶（LPS）、胃蛋白酶（PPS）活性与氰化高铁血红蛋白（HICN）含量采用比色法测定；谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）活性采用赖氏法测定；丙二醛（MDA）含量、总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）活性采用可见光法测定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用羟胺法测定；葡萄糖（GLU）含量采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定；尿素氮（UN）含量采用脲酶法测定；总胆固醇（TCHO）含量采用氧化酶法测定；甘油三酯（TG）含量采用甘油氧化酶法测定。血浆和肝脏中总蛋白（TP）含量采用考马斯亮蓝法测定。肠道组织结构分析：采用石蜡包埋和苏木精-伊红（HE）染色的方法制作石蜡切片，并在显微镜下观察，拍照。

5 计算公式

增重率（WGR，%）＝100×（W_t－W₀）/W₀；

特定生长率（SGR，%/D）＝100×（lnW_t-lnW₀）/t；

存活率（SR，%）＝100×N_t/N₀；料系数（FCR）＝F/（W_t-W₀）；

肝体比（HSI，%）＝100×W_h/W；脏体比（VSI，%）＝100×W_v/W；

肥满度（CF，g/cm³）＝100×W/L³；

饲料干物质表观消化率（%）＝100×（1-S_y/F_y）；

饲料中粗蛋白质或粗脂肪的表观消化率（%）＝100×［1-（F_i/S_i）×（S_y/F_y）］。

式中：W₀为鱼初始体重（g）；W_t为鱼终末体重（g）；t为试验天数（d）；N₀为初始鱼尾数；N_t为终末鱼尾数；W为体重；W_h为肝脏重；W_v为内脏团重；L为体长；S_y为饲料中三氧化二钇的含量（%）；F_y为粪便中三氧化二钇的含量（%）；S_i为饲料中粗蛋白质或粗脂肪的含量（%）；F_i为粪便中粗蛋白质或粗脂肪的含量（%）。

6 数据统计与分析试验数据采用SPSS 19.0分析软件的单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析，试验结果用平均值±标准差表示。单因素方差分析差异显著（P＜0.05）时，再采用Duncan氏法进行多重比较分析。

结果与分析

1 “泰添力”小肽蛋白部分替代鱼粉对大菱鲆生长性能的影响由表3可知，随着“泰添力”小肽蛋白替代鱼粉比例的增加，大菱鲆的增重率、肥满度、特定生长率均呈现先升高后降低的趋势，但D₈、D₁₆组与D₀组均无显著差异（P＞0.05），D₃₂组显著低于D₀、D₈、D₁₆、D₂₄组（P＜0.05）；试验鱼仅在D₃₂组出现死亡现象，D₃₂组的存活率显著低于D₀、D₈、D₁₆、D₂₄组（P＞0.05）；随着“泰添力”小肽蛋白替代鱼粉水平的增加，饲料系数、肝体比和脏体比呈现先降低后升高的趋势，D₃₂组显著低于D₀、D₈、D₁₆、D₂₄组（P＜0.05）。

2 “泰添力”小肽蛋白部分替代鱼粉对大菱鲆体成分的影响由表4可知，随着“泰添力”小肽蛋白替代鱼粉比例的增加，全鱼粗脂肪含量呈现逐渐降低的趋势，背肌粗脂肪含量先略有升高后逐渐降低，其中D₁₆、D₂₄、D₃₂组全鱼粗脂肪含量显著低于D₀、D₈组（P＜0.05），D₂₄、D₃₂组背肌粗脂肪含量显著低于D₀、D₈、D₁₆组（P＜0.05）；各组全鱼与背肌粗蛋白质、水分、粗灰分含量均无显著差异（P＞0.05）。

3 “泰添力”小肽蛋白部分替代鱼粉对大菱鲆营养物质表观消化率的影响由表5可知，随着“泰添力”小肽蛋白替代鱼粉比例的增加，干物质表观消化率、粗蛋白质表观消化率和粗脂肪表观消化率逐渐降低，D₂₄、D₃₂组显著低于D₀、D₈、D₁₆组（P＜0.05），而D₀、D₈、D₁₆组之间则无显著差异（P＞0.05）。

4 “泰添力”小肽蛋白部分替代鱼粉对大菱鲆肝脏中消化酶活性的影响由表6可知，随着“泰添力”小肽蛋白替代鱼粉比例的增加，肝脏中LPS活性无显著变化（P＞0.05）；D₀组肝脏中PPS活性显著高于D₈、D₁₆、D₂₄、D₃₂组（P＜0.05）；D₀、D₈组肝脏中PRS活性显著高于D₁₆、D₂₄、D₃₂组（P＜0.05）。

5 “泰添力”小肽蛋白部分替代鱼粉对大菱鲆血浆和肝脏中代谢酶活性的影响由表7可知，D₀、D₈、D₁₆组血浆中GOT、GPT活性显著低于D₂₄、D₃₂组（P＜0.05）；D₀、D₈组肝脏中GOT活性显著低于D₂₄、D₃₂组（P＜0.05），肝脏中GPT活性显著低于D₁₆、D₂₄、D₃₂组（P＜0.05）。

6 “泰添力”小肽蛋白部分替代鱼粉对大菱鲆血浆生化指标的影响由表8可知，D₀、D₈、D₁₆组血浆中TP含量显著高于D₂₄、D₃₂组（P＜0.05）；D₀、D₈组血浆中UN含量显著低于D₁₆、D₂₄、D₃₂组（P＜0.05）；D₀、D₈组血浆中TG含量显著高于D₁₆、D₂₄、D₃₂组（P＜0.05）；D₀、D₈、D₁₆、D₂₄组血浆中TCHO含量显著高于D₃₂组（P＜0.05）；D₀、D₈组血浆中GLU含量显著高于D₃₂组（P＜0.05）。

7 “泰添力”小肽蛋白部分替代鱼粉对大菱鲆血浆特异性免疫指标的影响由表9可知，D₈组大菱鲆血浆中C3、C4含量显著高于D₂₄、D₃₂组（P＜0.05）；血浆中HICN含量、CAT活性各组之间没有显著差异（P＞0.05）。

8 “泰添力”小肽蛋白部分替代鱼粉对大菱鲆血浆和肝脏抗氧化指标的影响由表10可见，D₈组血浆中SOD活性显著高于D₂₄、D₃₂组（P＜0.05），但与 D₀、D₁₆组无显著差异（P＞0.05），肝脏中SOD活性各组之间无显著差异（P＞0.05）；随着“泰添力”小肽蛋白替代鱼粉比例的增加，大菱鲆肝脏和血浆中T-AOC。

9 “泰添力”小肽蛋白部分替代鱼粉对大菱鲆肠道组织形态的影响由图1可以看出，“泰添力”小肽蛋白替代8%鱼粉时大菱鲆肠道组织皱襞间质宽度较小，皱襞较长，劲膜厚度较厚，肠道组织形态优于对照组；但随着“泰添力”小肽蛋白替代鱼粉比例的继续增加，大菱鲆肠道组织皱襞间质宽度逐渐变大且皱襞变短。

讨论

1 “泰添力”小肽蛋白部分替代鱼粉对大菱鲆生长性能和体成分的影响本试验是利用“泰添力”小肽蛋白部分替代（8%、16%、24%、32%）饲料中的鱼粉，结果显示，随着“泰添力”小肽蛋白替代鱼粉比例是增加，大菱鲆的增重率、特定生长率、肥满度呈现先升高后降低趋势，饲料系数先降低后升高，并且从数值上看D₈组的增重率、特定生长率、肥满度高于D₀组，饲料系数低于D₀组。这可能是由于本试验所用“泰添力”小肽蛋白的分子质量小于1000u的小肽约占90%，大多数可以被机体直接吸收利用，增加蛋白质的吸收速度，使机体分解蛋白质耗能降低，节约能量用于生长。饲料中添加小肽对水产动物具有显著的促进生长作用。饲料中添加适量的小肽可以促进大菱鲆的生长，并且能提高饲料的利用率。但是D₃₂组的增重率、特定生长率、存活率显著低于D₀组，可能是由于低分子质量的“泰添力”小肽蛋白会产生过多的氨基酸，使肠道的氨基酸转运系统饱和；也可能是由于替代比例的增加减弱了鱼粉中某些促生长因子的作用。研究发现，用小肽替代25%的鱼粉时，促进了海鲈幼鱼的生长，但用小肽替代50%和75%的鱼粉时，对海鲈幼鱼的生长却有抑制作用，与本试验研究结果一致。本试验中，随着“泰添力”小肽蛋白替代鱼粉比例的增加，大菱鲆的肝体比和脏体比呈现先降低后升高的趋势，可能由于添加过量的“泰添力”小肽蛋白会增加某些酶的分泌，导致肝脏的代偿性增大；全鱼和背肌的粗脂肪均呈现先升高后降低的趋势，其中D₂₄、D₃₂组显著低于D₀组，与于辉等的研究结果相似，可能是由于添加“泰添力”小肽蛋白阻碍了脂肪的吸收，加快脂质的代谢，其机理有待进一步研究。

2 “泰添力”小肽蛋白部分替代鱼粉对大菱鲆肝脏和血浆中代谢酶活性、肝脏中消化酶活性以及营养物质表观消化率的影响血浆中GPT、GOT活性是判断肝脏损伤程度的重要指标。GPT和GOT主要存在于肝脏中，一般情况下血浆中GPT和GOT的活性很低，如果肝脏内部受损，GPT和GOT因细胞膜通透性发生改变而进入血液，导致大菱鲆血浆中GPT和GOT活性升高，因此血浆中GPT和GOT的活性可反映肝脏的损伤情况。在本试验中，D₂₄、D₃₂组肝脏和血浆中GPT与GOT活性均显著低于D₀、D₈组，可能是由于小肽具有吸收速度较快、耗能较低、载体不易饱和等吸收特点，使氨基酸吸收速度加快，从而降低大菱鲆肝脏和血浆中GPT与GOT活性。此外，随着“泰添力”小肽蛋白替代鱼粉比例的增加，干物质表观消化率、粗蛋白质表观消化率和粗脂肪表观消化率呈现逐渐下降的趋势，可能是由于“泰添力”小肽蛋白替代鱼粉会导致饲粮的消化率将低和适口性变差。添加“泰添力”小肽蛋白对肝脏中LPS活性没有显著影响，肝脏中PPS、PRS活性则随着“泰添力”小肽蛋白替代鱼粉比例的增加先升高后降低，这与在海鲈和南美白对虾上得到的研究结果一致。这可能是由于小肽是肠腔的吸收底物，适量添加可以有效刺激和诱导小肠绒毛膜刷状缘酶活性的升高，加速绒毛生长，促进胃肠道等消化功能提前发育，使大菱鲆对营养物质的消化和利用更加充分。

3 “泰添力”小肽蛋白部分替代鱼粉对大菱鲆血浆生化指标的影响通过血液中TCHO和TG的含量可以看出动物体内脂肪沉积的情况。本试验中D₃₂组血浆TCHO、TG和GLU的含量显著低于D₀组，可能是由于“泰添力”小肽蛋白加速了脂类的代谢，抑制了GLU的合成。血浆TP含量是机体蛋白质代谢水平的重要参考指标之一，可以用来衡量蛋白质和氨基酸的利用率。本试验中血浆TP含量随着“泰添力”小肽蛋白添加比例的增加呈先升高后降低的趋势，可以看出添加适量“泰添力”小肽蛋白在一定程度上可以促进血清蛋白质的合成，进而提高机体的免疫力。UN是蛋白质代谢的主要终末产物，UN含量是反映肾功能的重要指标。本试验中，D₀、D₈组血浆中UN含量显著低于D₁₆、D₂₄、D₃₂组，可能是由于体内GPT活性显著升高加速了氨基酸的代谢，降低了蛋白质的分解，使氮在体内蓄积，从而加速了UN的生成。
4 “泰添力”小肽蛋白部分替代鱼粉对大菱鲆血浆特异性免疫指标及血浆和肝脏抗氧化指标的影响随着“泰添力”小肽蛋白添加比例的增加，血浆中CAT活性呈现先升高后降低的趋势，可以看出适量添加酶解肽可以增强酶促反应防御系统中CAT的活性，清除体内多余的活性自由基，增强机体的非特异性免疫。D₀、D₈组血浆中C3、C4含量显著高于D₂₄、D₃₂组，推测“泰添力”小肽蛋白中的部分小肽可能有助于大菱鲆提高自身的特异性免疫能力来增强机体的防御能力。